基于探針法和熔解曲線分析法，結(jié)合多色熒光檢測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)一個(gè)反應(yīng)中的多個(gè)靶標(biāo)。其探針采用雙標(biāo)記、自淬滅的TaqMan探針或分子信標(biāo)，檢測(cè)原理為：當(dāng)TaqMan探針游離于溶液中處于無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)時(shí)，或分子信標(biāo)由于莖部堿基的互補(bǔ)配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，探針上標(biāo)記的熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相對(duì)靠近，因熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)使得熒光信號(hào)較弱。而當(dāng)反應(yīng)體系中存在靶標(biāo)序列時(shí)，探針與靶標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)，形成伸展?fàn)顟B(tài)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相對(duì)遠(yuǎn)離，發(fā)射出較強(qiáng)的熒光信號(hào)。當(dāng)擴(kuò)增完成，產(chǎn)物量達(dá)到最高峰，熒光信號(hào)也最強(qiáng)，此時(shí)再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行升溫檢測(cè)，則雜交在產(chǎn)物上的探針與靶標(biāo)序列逐漸解離，形成無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)，熒光信號(hào)逐漸減弱，繪制溫度與熒光信號(hào)的變化曲線圖，即可進(jìn)行熔解曲線分析。
